Padronização de uma PCR multiplex para a detecção de fraude em leite bubalino e caprino por adição de leite bovino / Standardization of a multiplex PCR for detection of fraud in buffalo and goat milk by addition of bovine milk

O consumo de leite de espécies como bubalino e caprino tem se popularizado por representarem uma alternativa para indivíduos que possuem restrições alimentares relacionadas ao leite bovino e em virtude das propriedades nutricionais desses alimentos. No entanto, fatores como a baixa produção e a sazonalidade predispõem a adulterações destes alimentos, principalmente pela adição de leite bovino, visando maior rendimento e lucratividade. Assim, o objetivo do estudo foi padronizar um método de PCR multiplex para autenticação de leites bubalino e caprino. Para isso, amostras de leite exclusivamente de cada espécie foram utilizados para a padronização da técnica. Em seguida, foi realizada a fraude pela adição de leite bovino ao caprino e ao bubalino, em proporções de 0,1% até 100%. A técnica foi eficaz, precisa, rápida e prática para a detecção do DNA de bovino, bubalino e caprino, separadamente e em conjunto. Na fraude experimental, o limite de detecção da técnica ocorreu a partir do menor percentual testado (0,1%) tanto no leite caprino quanto no bubalino. Dessa forma, a PCR multiplex testada mostrou ser uma importante ferramenta para a autenticação de leite, pendendo ser utilizada para fins de fiscalização por órgãos competentes.

Milk consumption of species such as buffalo and goat has become popular due to the nutritional properties of these foods and because they represent an alternative for individuals who have dietary restrictions related to bovine milk. However, factors such as low production and seasonality predispose to adulteration, mainly by the addition of bovine milk, aiming at higher yield and profitability. Thus, the aim of the present study was to standard a multiplex PCR method for buffalo and goat milks authentication. For this, the milks exclusively of each species were used to standardize the technique. Subsequently, fraud was performed by the addition of bovine milk to goat and buffalo in proportions from 0.1% to 100%. The technique was effective and accurate for detecting bovine, buffalo and goat DNA separately and together quickly and practically. In experimental fraud, the detection limit of the technique occurred from the lowest percentage tested (0.1%) in both goat and buffalo milk. Thus, the multiplex PCR tested proved to be an important tool for milk authentication, pending to be used for supervision by competent agencies.

Otimização de protocolo para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi em polpa de açaí (Euterpe oleracea) / Protocol optimization for the detection of Trypanosoma cruzi DNA in açai (Euterpe oleraceae) pulp

A doença de Chagas, enfermidade causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, tem sido relacionada com frequência à transmissão oral pelo consumo de açaí. Métodos moleculares que fornecem uma identificação rápida e precisa do patógeno para a detecção da presença do parasita são de extrema importância para a detecção da presença do parasita neste alimento. Este estudo teve como objetivo otimizar a detecção de DNA de T. cruzi em polpa de açaí por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Foram preparadas várias diluições das formas tripomastigotas de T. cruzi DTU TcI cultivadas em meio de cultivo Liver Infusion Tryptose. O DNA de T. cruzi foi extraído das células e submetido à PCR. Posteriormente, as diluições da cultura foram adicionadas às polpas de açaí para avaliar o limite de detecção do novo ensaio de PCR otimizado. Mostramos que nosso ensaio pode detectar DNA de T. cruzi em polpas de açaí na concentração de 1.08 × 10-10 ng µL-1. Concluímos que a metodologia desenvolvida se mostra eficaz e pode ser uma ferramenta importante para a detecção de contaminação por T. cruzi em açaí.(AU)

Growth kinetics of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes in buffalo milk under different processing and storage conditions / Cinética de crescimento de Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes em leite bubalino sob diferentes condições de processamento e armazenamento

ABSTRACT: Buffalo milk is rich in nutrients and can serve as a substrate for the proliferation of microorganisms. Thus, the objective of the present study was to evaluate the growth kinetics of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes in buffalo milk under different processing and storage conditions. Samples of raw and pasteurized milk were inoculated with 1 CFU of each bacterium, separately and together, per 25 mL. After contamination, samples were stored at 8 °C or 37 °C, and bacterial counts were performed at 24, 48, and 168 h. In addition, the accompanying microbiota growth, pH, and the effect of these variables on the growth kinetics of microorganisms were monitored. The pathogens tested were able to proliferate under most conditions tested, reaching high titers throughout the experimental period. At 37 °C, there was a decrease in pH and an increase in the accompanying microbiota that interfered with the microbial growth curve. It was also observed that pasteurized milk subjected to 8 °C provided better conditions for the multiplication of bacteria. Therefore, it was concluded that care throughout the production chain, storage, and commercialization of milk must be adopted to guarantee the microbiological safety of this food.

RESUMO: O leite bubalino é rico em nutrientes e pode servir de substrato para a proliferação de micro-organismos. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a cinética de crescimento de Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes em leite bubalino, em diferentes condições de processamento e armazenamento. Para isso, utilizaram-se amostras de leite cru e pasteurizado, que foram inoculadas com 1 UFC/25 mL de cada bactéria separadamente e em conjunto. Após a contaminação, as amostras foram armazenadas nas temperaturas de 8 ºC e 37 ºC e realizadas contagens bacterianas em 24, 48 e 168h. Além disso, foi acompanhado o crescimento da microbiota acompanhante, o pH e o efeito dessas variáveis sobre a cinética de crescimento dos micro-organismos. Os patógenos testados conseguiram se proliferar na maioria das condições testadas, atingindo altos títulos durante todo o período experimental. Na temperatura de 37 ºC, houve uma diminuição do pH e um aumento da microbiota acompanhante, o que interferiu na curva de crescimento microbiana. Observou-se também que o leite pasteurizado e submetido a 8 ºC possibilitou melhores condições para a multiplicação das bactérias. Sendo assim, concluiu-se que cuidados durante toda a cadeia de produção, armazenamento e comercialização do leite devem ser adotados para garantir a segurança microbiológica desse alimento.

SYBR Green qPCR Technique for the Detection of Trypanosoma cruzi in Açaí Pulp.

Chagas disease, which is found widely in Latin America and has a great impact on public health, is caused by the parasite Trypanosoma cruzi. It is a neglected parasitic disease that urgently requires rapid diagnostic methods. The objective of this study was to develop a SYBR Green real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) technique for the direct identification and quantification of T. cruzi from experimentally contaminated açai fruit samples. We used discrete typing units, TcI, containing 3.5 × 104 cells/mL, to infect the pulp of the açai fruit. This was followed by DNA extraction using a standardized procedure. The DNA samples were quantified and amplified at specific time and temperature intervals. The specificity of the oligoinitiators used in the qPCR assays was estimated by calculating the primer dissociation curve (melting curve) along with a detection threshold using different concentrations of DNA. The method used here demonstrated good efficiency and precision for the detection and quantification of T. cruzi DNA, with a detection limit of 2.65 × 10-14 g/µL DNA. The qPCR technique presented here could serve as an important tool for the diagnosis of T. cruzi parasites in açai.

O probiótico Saccharomyces boulardii modula a resposta de IgG2a em camundongos expostos aos antígenos de Leishmania infantum / Probiotic Saccharomyces boulardii modulates IgG2a response in miceexposed to Leishmania infantum antigens

O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do probiótico Saccharomyces boulardii na modulação da resposta imune humoral de animais expostos a antígenos de Leishmania infantum. Para isso, 16 camundongos BALB/c foram imunizados com antígeno particulado de Leishmania infantum e divididos em dois grupos experimentais, um composto por animais suplementados e outro por animais não suplementados com o probiótico. Amostras de sangue dos animais foram colhidas semanalmente durante o período experimental e submetidas ao Ensaio da Imunoabsorbância Ligado à Enzima indireto para avaliação dos títulos de IgG totais e o perfil dos isotipos de IgG produzidos (IgG1 e IgG2a). A suplementação com o probiótico não exacerbou a produção de IgG total em comparação ao grupo controle, não havendo diferenças significativas entre os dois grupos. Porém, as soroconversões de IgG2a foram mais elevadas no grupo suplementado, no qual registrou-se um aumento de 1,46 vezes no final do experimento. Assim, a suplementação com S. boulardii foi capaz de modular a resposta de IgG2a/IgG1 nos animais expostos aos antígenos de Leishmania infantum.

The aim of the present study was to evaluate the effects of the Saccharomyces boulardii probiotic on the modulation of humoral immune response in animals exposed to Leishmania infantum antigens. For this, 16 BALB/c mice were immunized with Leishmania infantum particulate antigen and divided into two experimental groups, one consisting of supplemented animals and the other not probiotic supplemented animals. Blood samples from the animals were taken weekly during the experimental period and subjected to the Indirect Enzyme-Linked Immunosorbance Assay for evaluation of total IgG titers and the profile of the produced IgG isotypes (IgG1 and IgG2a). Probiotic supplementation did not exacerbate total IgG production compared to the control group, with no significant differences between the two groups. However, IgG2a seroconversions were higher in the supplemented group, which showed a 1.46-fold increase at the end of the experiment. Thus, supplementation with S. boulardii was able to modulate the IgG2a/IgG1 response in animals exposed to Leishmania infantum antigens.

Detection of fraud by addition cow's milk in cheese buffalo and its connection with seasonality / Detecção de fraude por adição de leite de vaca em queijo de búfala e a relação com a sazonalidade

The seasons influence the production of buffalos’ milk. Because of this, the producers may produce a mixture of buffalo and bovine milk during cheese production in periods of low production. Therefore, the present work aimed to investigate fraud in buffalo cheese and the relationship between seasonality and different physicochemical properties of buffalo cheeses produced and marketed in eastern Amazonia. We obtained commercial samples of buffalo cheese during two Amazonian climatic periods from commercial points of Marajó-Pará, Brazil. After collection, there were lipid, protein, ash, and humidity analyses. Determination of carbohydrates and energy values was also performed for the nutritional characterization of samples, as well as for mPCR analysis to detect buffalo and/or bovine DNA. DNA extraction protocol of the samples was standardized and two pairs were used for the mPCR reaction, amplifying fragments of approximately 220 bp for Bubalus bubalis DNA and 346 bp fragments for Bos taurus DNA. Among the samples acquired in the rainy season, we observed that 33% were inadequately labeled, indicating fraud from cow’s milk incorporation and fraud from substitution of raw material. From the nine samples obtained in the dry season, all the samples showed cow’s milk incorporation fraud. The highest fraud rate coincided with the period of low milk production from buffalo and there was a difference in composition between fraudulent and non-fraudulent cheeses. Therefore, seasonality influences increase in cattle milk for the production of buffalo cheese, and this adulteration may decrease the nutritional content of the product.

As estações climáticas influenciam a produção de leite de búfala. Isso pode levar os produtores a misturarem os leites de búfala e bovino durante a produção de queijo em períodos de baixa produção. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo verificar fraudes em queijo de búfala, a relação com a sazonalidade e as diferenças físico-químicas de queijos de origem bubalina, produzidos e comercializados no leste da Amazônia. Foram coletadas amostras comerciais de queijo de búfala em dois períodos climáticos da Amazônia em pontos comerciais do Marajó-Pará, Brasil. Após a coleta foram realizadas análises de lipídios, proteínas, cinzas e umidade. A determinação dos carboidratos e do valor energético também foi feita para a caracterização nutricional das amostras, bem como a análise de mPCR para a detecção de DNA de búfalo e/ou bovino. Para isso, padronizou-se um protocolo de extração de DNA das amostras e utilizou-se dois pares na reação mPCR, amplificar fragmentos de aproximadamente 220 pb para o DNA de Bubalus bubalis e fragmentos de 346 pb para o Bos taurus. Entre as amostras adquiridas na estação chuvosa, observou-se que 33% foram rotuladas inadequadamente, caracterizando fraude por incorporação de leite de vaca e fraude por substituição de matéria-prima. Das 9 amostras coletadas no período seco, todas as amostras apresentaram fraude na incorporação do leite de vaca. Este estudo revelou que a maior taxa de fraude coincide com o período de baixa produção de leite e que há uma diferença na composição entre queijos fraudulentos e não fraudulentos. Portanto, a sazonalidade influencia no acréscimo de leite de bovinos na produção de queijo de búfala e que esta adulteração pode diminuir o conteúdo nutricional do produto.

O probiótico Saccharomyces boulardii modula a resposta de IgG2a em camundongos expostos aos antígenos de Leishmania infantum / Probiotic Saccharomyces boulardii modulates IgG2a response in mice exposed to Leishmania infantum antigens

O objetivo do presente estudo foiavaliar os efeitos do probiótico Saccharomyces boulardii na modulação da resposta imune humoral de animais expostos a antígenos de Leishmania infantum. Para isso, 16 camundongos BALB/c foram imunizados com antígeno particulado de Leishmania infantum e divididos em dois grupos experimentais, um composto por animais suplementados e outro por animais não suplementados com o probiótico. Amostras de sangue dos animais foram colhidas semanalmente durante o período experimental e submetidas ao Ensaio da Imunoabsorbância Ligado à Enzima indireto para avaliação dos títulos de IgG totais e o perfil dos isotipos de IgG produzidos (IgG1 e IgG2a). A suplementação com o probiótico não exacerbou a produção de IgG total em comparação ao grupo controle, não havendo diferenças significativas entre os dois grupos. Porém, as soroconversões de IgG2a foram mais elevadas no grupo suplementado, no qual registrou-se um aumento de 1,46 vezes no final do experimento. Assim,a suplementação com S. boulardii foi capaz de modular a resposta de IgG2a/IgG1 nos animais expostos aos antígenos de Leishmania infantum.

The aim of the present study was to evaluate the effects of the Saccharomyces boulardii probiotic on the modulation of humoral immune response in animals exposed to Leishmania infantum antigens. For this, 16 BALB/c mice were immunized with Leishmania infantum particulate antigen and divided into two experimental groups, one consisting of supplemented animals and the other not probiotic supplemented animals. Blood samples from the animals were taken weekly during the experimental period and subjected to the Indirect Enzyme-Linked Immunosorbance Assay for evaluation of total IgG titers and the profile of the produced IgG isotypes (IgG1 and IgG2a). Probiotic supplementation did not exacerbate total IgG production compared to the control group, with no significant differences between the two groups. However, IgG2a seroconversions were higher in the supplemented group, which showed a 1.46-fold increase at the end of the experiment. Thus, supplementation with S. boulardii was able to modulate the IgG2a/IgG1 response in animals exposed to Leishmania infantum antigens.

Detection of fraud by addition cow's milk in cheese buffalo and its connection with seasonality / Detecção de fraude por adição de leite de vaca em queijo de búfala e a relação com a sazonalidade

The seasons influence the production of buffalos' milk. Because of this, the producers may produce a mixture of buffalo and bovine milk during cheese production in periods of low production. Therefore, the present work aimed to investigate fraud in buffalo cheese and the relationship between seasonality and different physicochemical properties of buffalo cheeses produced and marketed in eastern Amazonia. We obtained commercial samples of buffalo cheese during two Amazonian climatic periods from commercial points of Marajó-Pará, Brazil. After collection, there were lipid, protein, ash, and humidity analyses. Determination of carbohydrates and energy values was also performed for the nutritional characterization of samples, as well as for mPCR analysis to detect buffalo and/or bovine DNA. DNA extraction protocol of the samples was standardized and two pairs were used for the mPCR reaction, amplifying fragments of approximately 220 bp for Bubalus bubalis DNA and 346 bp fragments for Bos taurus DNA. Among the samples acquired in the rainy season, we observed that 33% were inadequately labeled, indicating fraud from cow's milk incorporation and fraud from substitution of raw material. From the nine samples obtained in the dry season, all the samples showed cow's milk incorporation fraud. The highest fraud rate coincided with the period of low milk production from buffalo and there was a difference in composition between fraudulent and non-fraudulent cheeses. Therefore, seasonality influences increase in cattle milk for the production of buffalo cheese, and this adulteration may decrease the nutritional content of the product.

As estações climáticas influenciam a produção de leite de búfala. Isso pode levar os produtores a misturarem os leites de búfala e bovino durante a produção de queijo em períodos de baixa produção. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo verificar fraudes em queijo de búfala, a relação com a sazonalidade e as diferenças físico-químicas de queijos de origem bubalina, produzidos e comercializados no leste da Amazônia. Foram coletadas amostras comerciais de queijo de búfala em dois períodos climáticos da Amazônia em pontos comerciais do Marajó-Pará, Brasil. Após a coleta foram realizadas análises de lipídios, proteínas, cinzas e umidade. A determinação dos carboidratos e do valor energético também foi feita para a caracterização nutricional das amostras, bem como a análise de mPCR para a detecção de DNA de búfalo e/ou bovino. Para isso, padronizou-se um protocolo de extração de DNA das amostras e utilizou-se dois pares na reação mPCR, amplificar fragmentos de aproximadamente 220 pb para o DNA de Bubalus bubalis e fragmentos de 346 pb para o Bos taurus. Entre as amostras adquiridas na estação chuvosa, observou-se que 33% foram rotuladas inadequadamente, caracterizando fraude por incorporação de leite de vaca e fraude por substituição de matéria-prima. Das 9 amostras coletadas no período seco, todas as amostras apresentaram fraude na incorporação do leite de vaca. Este estudo revelou que a maior taxa de fraude coincide com o período de baixa produção de leite e que há uma diferença na composição entre queijos fraudulentos e não fraudulentos. Portanto, a sazonalidade influencia no acréscimo de leite de bovinos na produção de queijo de búfala e que esta adulteração pode diminuir o conteúdo nutricional do produto.

Validação de uma técnica para a detecção de acréscimo de amido em amostras de açaí in natura / Validation of a technique for the detection of addition of starch in samples of açaí in natura

O trabalho visou validar a utilização do teste de lugol para a detecção de fraude por composto amiláceo e papel em amostras de açaí. Para tal, diferentes produtos foram adicionados e diluídos em água e açaí, respectivamente. A padronização em água mostrou-se efetiva para os produtos amiláceos, havendo falha no método em açaí, exceto para o amido de milho, carecendo-se de mais estudos que levem em consideração as diversas particularidades do fruto.

Probiotics Bacillus toyonensis and Saccharomyces boulardii improve the vaccine immune response to Bovine herpesvirus type 5 in sheep.

There have been significant efforts toward the development of more efficient vaccines for animal health. A strategy that may be used to improve vaccine efficacy is the use of probiotics. Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) is an example of an important animal pathogen for which vaccines have provided only limited protection. In this study, we examined the use of the probiotics Bacillus toyonensis and Saccharomyces boulardii as a potential immune modulator to improve vaccine efficiency. Thirty, 5-month-old lambs were randomly grouped in three lots of 10 each and vaccinated at days 0, 21 and 42 of the experiment. They grazed on the same pasture and were fed ad libitum twice a day with commercial sheep feed supplemented with either B. toyonensis (1×106CFU/g of feed) or S. boulardii (1×107CFU/g of feed), or non-supplemented feed. The probiotic supplementation was suspended day 28; thereafter, the next 35days, they were fed with the same commercial feed as control group. Animals supplemented with probiotics showed a significant (p>0.001) increased seroconversions against BoHV-5, and higher neutralizing antibodies titres (p>0.05) to BoHV-5 than non-supplemented animals. At 63days of experiment, splenocytes from the supplemented sheep had higher mRNA transcription levels of cytokines IL-10 and IL-17A. These results suggest that these probiotics could provide a promising means of improving vaccine efficacy.

Brazilian ground beef authentication by multiplex polymerase chain reaction / Autenticação de carne moída brasileira através de uma reação em cadeia da polimerase multiplex

ABSTRACT: The aim of the present study was to assess the efficacy ofmultiplex PCR in detecting the adulterationof commercially available ground beefvia addition and/orsubstitution ofground buffalo meat. Experimentally adulterated ground beefsamples were prepared in triplicate, and dilutions of DNA from Bos taurus and Bubalusbubalis were prepared to determine the detection limit of the method. Concurrently, 91 ground meatsamples sold as "ground beef" were collected from differentstores in northern Brazil andanalyzed bymultiplex PCR. Buffalo DNA was detected in 17.5% of the collected ground meat samples.Our results showed that multiplex PCR is an efficient method for detectingthe incorporation of groundbuffalo meatatpercentages ranging from 10 to 100% and the incorporation of beef at percentages ranging from0.1 to 100% intoground meat samples.

RESUMO: O objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia da PCR multiplex na detecção da adulteração por adição e/ou substituição de carne bubalina em carne moída bovina, comercialmente disponível. A fim de determinar o limite de detecção da técnica, carnes moídas bovinas fraudadas intencionalmente foram fabricadas em triplicata e, adicionalmente, concentrações conhecidas de DNA das espécies Bostaurus e Bubalusbubalis foram diluídos. Ao mesmo tempo, 91 amostras de carne moída comercializadas como sendo de origem bovina foram coletadas em diferentes comércios na região Norte do Brasil e a PCR multiplex proposta foi realizada. Os resultados demonstraram que o DNA bubalino foi detectado em 17,5% das amostras de carne moída coletadas. Concluiu-se que a PCR multiplex é uma técnica eficaz, capaz de detectar a incorporação de carne moída bubalina em percentagens que variaram de 10 a 100%, e a incorporação de carne bovina em percentagens que variaram de 0,1 a 100% em amostras de carne moída.

Avaliação higiênico-sanitária de estabelecimentos comerciais e análise de micro-organismos indicadores em amostras de carne bovina (coxão mole) in natura comercializadas em mercados públicos / Sanitary inspection of commercial establishments and analysisof the microorganism indicators in the bovine pad topside meatsamples sold in public markets

O objetivo deste estudo foi analisar as condições higinicos-sanitárias dos mercados públicos dos municípios da microrregião de Cametá, estado do Pará, e avaliar as características microbiológicas das carnes comercializadas nestes locais por meio da pesquisa de micro-organismos indicadores. Sessenta e quatro amostras de carne bovina in natura foram coletadas e analisadas por meio da determinação do Número Mais Provável de coliformes a 35 oC e 45 oC e contagem de Staphylococcus coagulase positiva, de acordo com a Instrução Normativa no 62 de 2003 do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Paralelamente, as condições higiênico-sanitárias foram avaliadas aplicando-se checklist. Os resultados obtidos evidenciaram que todos os locais avaliados apresentaram condições higiênico-sanitárias insatisfatórias, sendo classificados como deficientes. As amostras apresentaram Número Mais Provável de coliformes a 35ºC e 45ºC que variaram de 64 NMP/g a >1100NMP/g, e contagens de Staphylococcus coagulase positiva entre 1,8 x 10² UFC/g e 2,3 x 105 UFC/g.Os estabelecimentos avaliados não atenderam às exigências mínimas de higiene e sanidade, e a carnecomercializada apresentou elevada contagem de micro-organismos indicadores.

The aim of this study was to analyze the sanitary conditions of public markets located in theCametá micro-region, state of Pará, and to assess the microbiological condition of the meat sold inthese locations through the determination of microorganism indicators. For this purpose, 64 fresh beefsamples were collected and the determination of the Most Probable Number of coliforms at 35 oC and45 oC and coagulase positive Staphylococcus counts were performed, according to the Instruction no 62,2003 of the Ministry of Agriculture Livestock and Supply. In addition, the hygienic and sanitary conditionsof the public markets were evaluated by applying a checklist. The found results showed that all of theevaluated public markets indicated poor hygienic sanitary condition, and they were ranked as deficient.The samples showed the Most Probable Number of coliforms at 35 oC and 45 oC ranging from 64 MPN/gto >1100NMP/g, and coagulase positive Staphylococcus counts between 1.8 x 10² CFU/g and2.3 x 105 CFU/g. The evaluated food markets did not meet the minimum requirements of hygiene andsanitation and the sold meat samples showed high count of microorganisms indicators.

Avaliação da técnica PCR multiplex para detecção de fraude por adição de carne bubalina em carne moída bovina / Evaluation of a multiplex PCR for detection of a fraud in the minced beef meat by adding buffalo meat

O presente trabalho avaliou a sensibilidade de uma modalidade de técnica de PCR multiplex para efetuar a detecção de fraude por adição intencional de carne moída bubalina em carne moída bovina. Neste contexto,as amostras de carnes moídas de bovinos com adição de 0,01 %, 0,1 %, 1,0 %, 5,0 %, 10,0 %, 25,0 %, 50,0 %,75,0 %, 90,0 %, 95,0 %, 99,0 %, 99,9 %, 99,99 % de carne moída bubalina foram produzidas em triplicata com cinco réplicas. As carnes moídas exclusivamente de cada uma das espécies foram utilizadas como amostras controle. Cada uma das amostras produzidas foi analisada por meio de Reação em Cadeia da Polimerase multiplex. A fim de realizar a análise da sensibilidade do teste, percentagens conhecidas de amostras de DNA (0,01 %, 0,1 %, 1,0 %, 5,0 %,10,0 %, 25,0 %, 50,0 %, 75,0 %, 90,0 %, 95,0 %, 99,0 %, 99,9 %, 99,99 %) das espécies Bos taurus e Bubalus bubalis foram diluídas e misturadas em um volume final de 10 μL; e estas foram também analisadas pela metodologia de PCR proposta. A técnica de PCR multiplex mostrou ser eficaz e de alta sensibilidade, capaz de detectar incrementos de 10,0 % (2,05 ng) de DNA bubalino e de 0,1 % (0,041 ng) de DNA bovino...

The role of quorum sensing in Escherichia coli (ETEC) virulence factors.

Quorum sensing (QS) is a signaling system among bacteria mediated by auto-inducer substances (AI). Whenever the concentration of these molecules reaches a threshold corresponding to a high cell density or quorum, the whole population starts a coordinated expression of specific genes. Studies have shown that epinephrine is also responsible for activating specific bacterial genes. This work aimed to investigate the role of conditioned medium (containing AI), epinephrine and their association on growth, motility, F4 fimbriae and heat-labile toxin (LT) expression on enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC, E68). A significant increase in motility, F4 and LT expression, was observed in the ETEC culture supplemented with conditioned medium and epinephrine. These findings suggest that ETEC uses some components of conditioned medium (e.g., AI molecules), host molecules (epinephrine), and their association to modulate the expression of important virulence genes.

Use of ELISA based on NcSRS2 of Neospora caninum expressed in Pichia pastoris for diagnosing neosporosis in sheep and dogs.

Neosporosis is a disease caused by the protozoon Neospora caninum that leads to significant economic losses in many countries. In the present study, we report on use of the recombinant protein NcSRS2 of N. caninum expressed in Pichia pastoris in an indirect immunoenzymatic assay (ELISA) for diagnosing neosporosis infection in sheep and dogs. We observed that the ELISA test yielded specificity of 94.5% and sensitivity of 100% for sheep and specificity of 93.3% and sensitivity of 100% for dogs. We observed that the sensitivity was higher than shown by the indirect fluorescent antibody test, and this was confirmed by means of Western blot. The results from this study suggest that the recombinant protein expressed in P. pastoris is a suitable antigen for use in immunodiagnosis to detect N. caninum in two important species exposed to this parasitosis.

Use of ELISA based on NcSRS2 of Neospora caninum expressed in Pichia pastoris for diagnosing neosporosis in sheep and dogs / Utilização de um ELISA baseado em NcSRS2 de Neospora caninum expressa em Pichia pastoris para diagnóstico de neosporose em ovinos e cães

Neosporosis is a disease caused by the protozoon Neospora caninum that leads to significant economic losses in many countries. In the present study, we report on use of the recombinant protein NcSRS2 of N. caninum expressed in Pichia pastoris in an indirect immunoenzymatic assay (ELISA) for diagnosing neosporosis infection in sheep and dogs. We observed that the ELISA test yielded specificity of 94.5% and sensitivity of 100% for sheep and specificity of 93.3% and sensitivity of 100% for dogs. We observed that the sensitivity was higher than shown by the indirect fluorescent antibody test, and this was confirmed by means of Western blot. The results from this study suggest that the recombinant protein expressed in P. pastoris is a suitable antigen for use in immunodiagnosis to detect N. caninum in two important species exposed to this parasitosis.

A neosporose é uma doença causada pelo protozoário Neospora caninum que leva a perdas econômicas importantes em muitos países. No presente estudo, é descrita a utilização da proteína recombinante NcSRS2 de N. caninum expressa em Pichia pastoris em um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) para o diagnóstico de infecção por Neospora em ovelhas e cães. Observou-se, que utilizando-se um ELISA, o teste produziu uma especificidade de 94,5% e uma sensibilidade de 100% para ovinos; e uma especificidade de 93,3% e sensibilidade de 100% para cães. Uma maior sensibilidade foi observada em relação à IFI que foi confirmada por Western blot. Os resultados deste estudo sugerem que a proteína recombinante expressa em P. pastoris é bom antígeno para ser utilizado no diagnóstico imunológico para detectar N. caninum em duas espécies importantes expostas a esta parasitose.

Detecção de fraude em amostras comerciais de queijo bubalino por adição de leite bovino por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) multiplex / Detection of fraud of cow milk addition into the commercially available buffalo cheese samples by multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR)

No presente estudo foi verificada a eficiência da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) multiplex para detecção de fraude por adição de leite bovino em queijo de búfala, e para identificar amostras dequeijo fraudadas no comércio de municípios dos estados do Pará e Amapá. Os queijos de búfalacontendo 10 %, 25 %, 50 %, 75 % e 90 % de leite bovino foram produzidos, bem como os queijos exclusivamente de vaca e búfala (controles). Essas amostras foram analisadas por meio de Reação em Cadeia da Polimerase. Posteriormente, 44 amostras de queijos bubalinos foram coletadas na região alvo doestudo e a PCR multiplex foi novamente utilizada, visando à detecção de fraude. Os resultados obtidos demonstraram que os iniciadores utilizados neste trabalho foram capazes de detectar o incremento de todasas percentagens de leite de vaca nos queijos de búfala experimentalmente fraudados, e que 13,6 % das amostras comercialmente disponíveis continham leite bovino. PCR multiplex é uma técnica capaz de detectar adição de valores a partir de 10 % de leite bovino não declarado na rotulagem de queijo de búfala,e este tipo de fraude foi encontrado nas amostras comercializadas nos municípios do Amapá e Pará, Brasil...

The use of sodic monensin and probiotics for controlling subacute ruminal acidosis in sheep / O uso de monensina sódica e probióticos para o controle de acidose ruminal subaguda em ovinos

It was to validated a protocol for induction of subacute ruminal acidosis (SARA) (Experiment 1) and test the efficiency of probiotic Saccharomyces cerevisiae or monensin to avoid pH ruminal drops in sheep (Experiment 2). In Experiment 1, six ewes were fasted for two days and then fed most with concentrate during four days. Ewes in this protocol had ruminal fluid pH below 6.0 and kept it for 75 consecutive hours. In Experiment 2, 18 sheep were distributed into three groups: Control (CG, n = 6), monensin (MG, n = 6) and probiotic group (PG, n = 6). SARA was induced according Experiment 1. PG had lower pH (5.7 ± 0.1) than CG (6.0 ± 0.1) (P = 0.05), while MG (5.7 ± 0.1) was similar to both during SARA induction. SARA induction reduced ruminal protozoa population (P < 0.05) and increased chloride concentrations in ruminal fluid (P < 0.01). In serum, SARA increased concentrations of phosphorus (P < 0.01), AST (P < 0.01) and GGT (P < 0.01), but reduced LDH (P < 0.01). In conclusion, the protocol used for SARA induction was able to maintain ruminal pH between 5.5-6.0 for more than 48 hours. However, monensin and probiotics supplementation was not effective in preventing changes in ruminal and serum parameters during SARA.

Foi validado um protocolo para a indução de acidose ruminal subaguda (SARA) (Experimento 1) e testar a eficácia do probiótico Saccharomyces cerevisiae ou monensina na prevenção da queda do pH do fluido ruminal em ovinos (Experimento 2). No Experimento 1, seis ovelhas foram mantidas em jejum por dois dias e, em seguida, alimentadas basicamente com concentrado durante quatro dias. Nesse protocolo as ovelhas mantiveram o pH do fluido ruminal abaixo de 6,0 por 75 horas consecutivas. No Experimento 2, 18 ovelhas foram distribuídas em três grupos: controle (GC, n = 6), monensina (GM, n = 6) e o grupo probiótico (GP, n = 6). A SARA foi induzida de acordo com o Experimento 1. GP apresentaram valores de pH mais baixos (5,7 ± 0,1) do que o GC (6,0 ± 0,1) (P = 0,05), enquanto GM (5,7 ± 0,1) foi semelhante durante a indução de SARA. A indução SARA reduziu a população de protozoários no rúmen (P < 0,05) e aumentou a concentração de cloreto no líquido ruminal (P < 0,01). Durante a SARA observou-se aumento das concentrações séricas de fósforo (P < 0,01), AST (P < 0,01) e GGT (P < 0,01), mas reduziu a de LDH (P < 0,01). Em conclusão, o protocolo utilizado para a indução de SARA foi capaz de manter o pH do rúmen entre 5,5-6,0 por períodos superiores a 48 horas. No entanto, a suplementação com monensina e probióticos não foi eficaz na prevenção das alterações nos parâmetros ruminais e séricos durante SARA.

Expression of Neospora caninum NcSRS2 surface protein in Pichia pastoris and its application for serodiagnosis of Neospora infection.

Neospora caninum is considerd a major cause of abortion in cattle worldwide. The antigenic domain of NcSRS2 in N. caninum is an important surface antigen present in the membrane of this parasite. In the present study, the Pichia pastoris expression system proved to be a useful tool for the production of recombinant protein. The truncated NcSRS2 gene (by removal of the N-terminal hydrophobic sequence), was cloned in the vector pPICZalphaB, and integrated on the genome of the methylotrophic yeast P. pastoris. Subsequently, the NcSRS2 protein was expressed, purified, and characterized using naturally infected cattle sera and Mab 6xhistag. The recombinant protein NcSRS2 was present in the supernatant of the culture, where later it was concentrated and purified using ammonium sulfate (∼100 mg/ml). An indirect immunoenzymatic assay (ELISA) was performed using cattle sera from endemic N. caninum area.

The immune modulation of Bacillus cereus var. Toyoi in mice immunized with experimental inactivated Bovine Herpesvirus Type 5 vaccine.

In recent years, there been significant progress toward develop more efficient vaccines. Different compounds with adjuvant capacity have been tested; however, no compound has emerged that suitable for universal use. Several efforts have been made to produce effective vaccines against Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5), an important cattle pathogen. In this study we examine the use the probiotic Bacillus cereus var. Toyoi as a potential adjuvant to improve BoHV-5 vaccine efficacy. We observed in the supplemented animals a systemic enhanced IgG antibody response toward Th1, and increased IFN-γ, IL-12 and IL-10 cytokines mRNA levels. These results suggest that this probiotic could provide a promising means of improving vaccine efficacy, particularly those vaccines that rely on a cell-mediated immune response.